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以下内容由 ChatGPT 根据英文原文自动翻译，已尽量保持术语准确性和表达清晰度，供参考。
1. 背景
RNA修饰在转录后调控中发挥着重要作用。其中，glycoRNA（糖化RNA），即与糖链共轭的RNA，是近年来被发现但仍未被充分理解的一类新型生物分子。Flynn 等人于2021年首次报道了其存在，并检测到糖基化的小RNA(Ryan, et al., Cell, 2021)。然而，由于缺乏合适的成像方法，其在细胞中的具体分布和潜在功能仍不清楚。
为了解决这一问题，Ma 等人开发了一种原位成像新技术，命名为 ARPLA（Aptamer and RNA in situ hybridization-mediated Proximity Ligation Assay，核酸适配体与RNA原位杂交介导的近邻连接反应）。该方法旨在实现对glycoRNA的高空间分辨率、高选择性及序列特异性检测 (Yuan Ma, et al., Nat Biotechnol, 2024)。
2. ARPLA 原理
ARPLA整合了两种分子识别策略：
- 基于核酸适配体的糖链识别：一种单链DNA适配体可选择性结合glycoRNA上常见的唾液酸残基；
- RNA原位杂交（RISH）：DNA探针与目标RNA序列发生杂交。
当这两个识别事件在空间上接近时，它们能借助T4 DNA连接酶实现连接，从而形成闭合的DNA环结构。此闭环DNA可作为滚环扩增（RCA）的模板，通过聚合酶反应产生大量重复序列，随后使用荧光标记的寡核苷酸进行可视化检测。
这一双重识别策略可确保仅有同时具有特定糖链和序列的RNA才被扩增和成像，从而提高检测的特异性与信噪比。
2.2. 背景介绍：核酸适配体
核酸适配体（Aptamer）是短的单链DNA或RNA分子，能够折叠形成特定的三维结构，从而以高亲和力和高特异性结合目标分子，如蛋白质、小分子，甚至是细胞。功能上类似于抗体。
2.2.1 技术来源
核酸适配体的概念始于1990年，两项独立研究奠定了其基础：
- Craig Tuerk 和 Larry Gold 首次提出了SELEX（系统进化筛选）技术，展示了可选择与噬菌体T4 DNA聚合酶结合的RNA序列 (C Tuerk, et al., Science, 1990)；
- Andrew D. Ellington 和 Jack W. Szostak 采用类似的方法筛选能够与有机染料结合的RNA分子。他们创造了“Aptamer（核酸适配体）”这一术语，来源于拉丁语“aptus”（适合）和希腊语“meros”（部分），用以描述这类核酸适配体 (A D Ellington, et al., Nature, 1990)。
这两项开创性研究奠定了核酸适配体筛选的基础技术——SELEX。
2.2.2 自然来源
自然界中也存在类似核酸适配体结构的RNA，称为核糖开关（Riboswitch）。它们通常存在于细菌mRNA的非翻译区，可结合小分子代谢物，并根据其浓度调控基因表达。其中，核酸适配体结构域负责识别配体，而表达平台则调控下游基因表达 (Leurin Flemmich, et al., Nat Commun, 2021)。
核糖开关的存在也支持“RNA世界假说”（RNA World Hypothesis），即生命早期可能完全依赖RNA进行遗传信息的储存和催化功能 (Kumari Kavita, et al., Trends Biochem Sci, 2022)。
2.3. 背景介绍：滚环扩增（RCA）
滚环扩增（RCA）是一种等温核酸扩增技术，利用圆形DNA模板和具备链置换能力的DNA聚合酶，合成长链单链DNA或RNA。
2.3.1 技术来源
RCA技术始于1990年代中期，用于扩增圆形DNA模板。核心酶为phi29 DNA聚合酶，源自枯草芽孢杆菌噬菌体phi29。该酶具有高过程性和强链置换活性，非常适合RCA使用 (Wikipeida; M Monsur Ali, et al., Chem Soc Rev, 2014)。
RCA的应用包括但不限于：(phi29 DNA Polymerase, product webpage, Thermo Fisher)
- DNA生物传感器
- 近邻连接反应
- 原位杂交成像
其等温性质无需热循环设备，简化了实验平台。
2.3.2 自然来源
RCA技术的灵感来自于自然界中的滚环复制（RCR），被用于复制各种圆形DNA或RNA。其天然实例包括：噬菌体（如φX174、M13）、质粒、类病毒及部分真核病毒。在RCR中，DNA上的切口引发单向复制，从而连续产生多个拷贝 (Shuzhen Yue, et al., Trends Biotechnol, 2021)。
3. 实验验证
作者使用HeLa细胞模型验证了ARPLA方法。若缺失任一关键组分（核酸适配体、RISH探针、连接臂），信号强度显著下降。此外，酶解或药物处理去除糖链（如PNGase-F、神经氨酸酶、kifunensine）或RNA片段（RNase A/T1）均可导致信号丧失，证明该方法对完整glycoRNA的依赖性。
所用核酸适配体为Neu5Ac结合型DNA适配体，通过等温滴定量热法（ITC）测得其解离常数Kd约为91 nM，表明其具有良好的结合亲和力。使用无序适配体或识别不同糖链（如Tn抗原、GalNAc）的核酸适配体均未产生明显信号。
3.1. 不同GlycoRNA与细胞类型中的应用
ARPLA成功检测了几种glycoRNA，包括：
- U1 snRNA：参与剪接，主要定位于细胞核；
- U35a snoRNA：功能为rRNA修饰；
- Y5 RNA：与DNA复制和RNA稳定性相关。
这些RNA代表了不同类别及亚细胞定位。ARPLA在多种细胞系（HeLa, SH-SY5Y, PANC-1, HEK293T）中均能成功检测其膜相关形式，表明该方法具有较强的普适性。
3.2. 亚细胞定位与胞内转运
共聚焦显微成像显示glycoRNA富集于脂筏微区，表现为与CT-B（霍乱毒素B亚基）和GM1神经节苷脂共定位。此外，其还与SNARE蛋白（TSNARE1和VTI1B）共定位，提示其可能参与囊泡介导的分泌过程。
这些结果支持一种模型：特定glycoRNA可通过分泌囊泡被转运至质膜。
3.3. 在癌症与免疫细胞模型中的应用
3.3.1 癌症进展
作者使用ARPLA检测乳腺癌细胞中glycoRNA表达，覆盖不同恶性程度的细胞系：
- MCF-10A（非肿瘤性）
- MCF-7（恶性）
- MDA-MB-231（转移性）
结果显示，U1、U35a和Y5 glycoRNA的ARPLA信号随恶性程度升高而下降。这一趋势与癌细胞中常见的高唾液酸化（hypersialylation）相反，提示glycoRNA与蛋白糖基化可能存在独立调控机制。
3.3.2 免疫激活
在PMA诱导THP-1单核细胞向巨噬细胞分化过程中，glycoRNA水平下降。而经LPS刺激激活的巨噬细胞，其glycoRNA信号重新上升，提示在免疫应答过程中glycoRNA呈动态调控状态。RNase处理还显著降低细胞与内皮层的黏附能力，表明glycoRNA可能参与免疫细胞与内皮细胞的相互作用。
4. 方法局限性
尽管ARPLA在空间定位和序列特异性方面具有优势，但仍存在以下限制：
- 需已知序列信息：无法检测未知序列的glycoRNA；
- 信号强度有限：对于低丰度目标，荧光信号可能较弱；
- 分辨率受限：约为300纳米，难以区分彼此靠近的分子；
- 半定量性质：信号强度与glycoRNA丰度相关，但无法提供绝对分子数。
总结
ARPLA结合了核酸适配体识别糖链与RNA序列杂交，技术路线严谨，为glycoRNA的成像分析提供了新工具，尤其在肿瘤与免疫研究中具有广泛前景。未来可通过优化探针设计与成像灵敏度进一步提升其应用价值。
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